Prof. Tong Zhang STOTEN, Universitas Hong Kong: Evaluasi metode deteksi coronavirus baru dalam air limbah

Deteksi dan analisis novel coronavirus (SARS-CoV-2) dalam air limbah setelah wabah dapat memberikan informasi pendukung penting untuk pengujian medis, termasuk memberikan sinyal peringatan dini wabah, melacak perkembangan wabah di masyarakat, dan mengidentifikasi kasus-kasus tak terlihat di masyarakat.

Tidak seperti sampel klinis, RNA neocoronavirus dalam sampel air limbah sangat encer karena pengaruh populasi masyarakat, oleh karena itu, konsentrasi virus diperlukan sebelum pengujian. Makalah ini mengevaluasi dampak dari sebelas proses metodologis yang berbeda pada efikasi deteksi neocoronavirus dalam air limbah, termasuk perbandingan delapan metode volume kecil, perbandingan metode volume besar versus volume kecil, dan perbandingan dua metode ekstraksi yang berbeda.

图文摘要 | Graphical abstract

Pendahuluan

Deteksi dan analisis novel coronavirus (SARS-CoV-2) dalam air limbah setelah wabah dapat memberikan informasi pendukung penting untuk pengujian medis, termasuk memberikan sinyal peringatan dini wabah, melacak perkembangan wabah di masyarakat, dan mengidentifikasi kasus-kasus tak terlihat di masyarakat. Tidak seperti sampel klinis, RNA neocoronavirus dalam sampel air limbah sangat encer karena pengaruh populasi masyarakat, oleh karena itu, konsentrasi virus diperlukan sebelum pengujian. Makalah ini mengevaluasi dampak dari sebelas proses metodologis yang berbeda pada efikasi deteksi neocoronavirus dalam air limbah, termasuk perbandingan delapan metode volume kecil, perbandingan metode volume besar versus volume kecil, dan perbandingan dua metode ekstraksi yang berbeda.

Perbandingan delapan metode konsentrasi menggunakan volume awal kecil

Sampel limbah yang dikumpulkan dinonaktifkan dan kemudian virus SARS-CoV-2 yang dinonaktifkan ditambahkan untuk evaluasi metode. Untuk sampel volume kecil, delapan proses metodologis berdasarkan empat prinsip metodologis yang berbeda dievaluasi. Ditemukan bahwa metode ultrasentrifugasi menunjukkan pemulihan tertinggi (25.4 ± 5.9%) dan secara signifikan lebih tinggi (p < 0.01) daripada prinsip metode lainnya, diikuti oleh sedimentasi dan ultrafiltrasi sentrifugal, dan terakhir oleh adsorpsi-elusi membran (Gbr. 1).

Gbr. 1 Perbandingan delapan metode volume kecil

(a) Nilai Ct (b) pemulihan UC: Ultrasentrifugasi (150,000 × g, 60 menit); AlCl3: Flokulasi dan presipitasi AlCl3 (1%, 0.3 M, v/v); PEG: Presipitasi PEG (10% PEG, w/v, dan 2% NaCl, w/v); MgCl2: Presipitasi MgCl2 (1%, 2.5 M, v/v). A15: Ultrafiltrasi sentrifugal (menggunakan Filter Sentrifugal Amicon-Ultra 15 dengan setara molekul 10 kDa); C70: Ultrafiltrasi sentrifugal (menggunakan Filter Sentrifugal Centricon Plus-70 dengan setara molekul 30 kDa); AlM: Adsorpsi-elusi membran (0.45% NaCl, w/v, dan 2% NaCl, w/v); MgCl2: Presipitasi MgCl2 (1%, 2.5 M, v/v); AlM: Adsorpsi-elusi membran (0.45% NaCl setelah menambahkan AlM: Adsorpsi-elusi membran (membran filter bermuatan negatif 0.45 μm setelah penambahan AlCl3 untuk adsorpsi-elusi); MgM: Adsorpsi-elusi membran (membran filter bermuatan negatif 0.45 μm setelah penambahan MgCl2 untuk adsorpsi-elusi).

Perbandingan metode konsentrasi volume besar dan volume kecil

Untuk menjajaki kemungkinan penggunaan volume limbah yang lebih besar (1000 mL) untuk meningkatkan sensitivitas metode, tiga metode volume besar dibandingkan dengan metode volume kecil yang optimal (ultrasentrifugasi). Dalam sampel limbah yang diperkaya dengan SARS-CoV-2, meskipun sensitivitas metode ultrasentrifugasi volume besar lebih baik daripada dua metode volume besar lainnya (presipitasi AlCl3 dan adsorpsi membran), metode ini hanya mencapai sensitivitas yang mirip dengan metode ultrasentrifugasi volume kecil. Dalam sampel limbah yang diperkaya dengan SARS-CoV-2 dan pada konsentrasi ambang batas, metode volume besar dan volume kecil mencapai rentang deteksi yang sama. Dalam 35 sampel limbah nyata yang tidak diperkaya dengan SARS-CoV-2, metode ultrasentrifugasi volume besar dan volume kecil menunjukkan tingkat deteksi yang sama, dengan metode volume besar memiliki nilai Ct yang sedikit lebih rendah (0.67 Ct) daripada metode volume kecil. Hasil ini menunjukkan bahwa peningkatan volume limbah tidak secara signifikan meningkatkan sensitivitas metode, mungkin karena efek matriks dari limbah yang secara serentak terkonsentrasi dalam metode volume besar, yang tidak kondusif untuk ekstraksi dan deteksi RNA berikutnya.

Gbr. 2 Perbandingan metode volume besar dan volume kecil

(a) Perbandingan nilai Ct antara tiga metode volume besar dan metode volume kecil yang optimal; (b) Perbandingan nilai Ct antara metode ultrasentrifugasi volume besar dan volume kecil berdasarkan 35 sampel limbah nyata yang tidak berlabel.

Large-UC: ultrasentrifugasi volume besar (20,000 × g selama 30 menit, kemudian 150,000 × g selama 60 menit); AlCl3: Flokulasi dan presipitasi AlCl3 (1%, 0.3 M, v/v); Membran: adsorpsi-elusi membran (adsorpsi-desorpsi menggunakan membran 0.45 μm bermuatan negatif); Small-UC: ultrasentrifugasi volume kecil (150,000 × g selama 60 menit). UC: ultrasentrifugasi volume kecil (ultrasentrifugasi 150,000 × g selama 60 menit).

Tabel 1 Tingkat deteksi dan nilai Ct untuk sampel limbah yang diperkaya dengan SARS-CoV-2 pada konsentrasi kritis dan untuk sampel limbah nyata tanpa pengayaan.

Perbandingan dua metode ekstraksi

Metode ultrasentrifugasi volume kecil digunakan untuk memekatkan sampel limbah dengan membandingkan dua metode ekstraksi RNA yang berbeda. Hasil penelitian menunjukkan bahwa QIAamp Viral RNA Kit (Viral Kit) mampu mendeteksi nilai Ct yang lebih rendah daripada TRIzol Plus RNA Purification Kit (TRIzol Kit) dalam sampel limbah yang diperkaya dengan SARS-CoV-2 hingga berbagai efek matriks (Gbr. 3a), dan bahwa QIAamp Viral RNA Kit (Viral Kit) mampu mendeteksi berbagai konsentrasi hingga sampel konsentrasi rendah dalam sampel limbah yang diperkaya dengan SARS-CoV -2 dan pada konsentrasi kritis dalam sampel limbah, Viral Kit mampu mendeteksi berbagai konsentrasi hingga sampel konsentrasi rendah, sedangkan TRIzol Kit hanya mampu mendeteksi sampel konsentrasi sedang (Tabel 1, Gambar 3b). Dalam sampel yang diencerkan dalam PBS (salin) atau gradien limbah, Viral Kit menunjukkan efisiensi ekstraksi yang lebih tinggi daripada TRIzol Kit (Gambar 3c dan Gambar 3d). Hasil ini menunjukkan bahwa Viral Kit bekerja lebih baik daripada TRIzol Kit, tetapi keduanya memiliki hasil ekstraksi yang lebih baik.

Gbr. 3 Perbandingan kedua metode ekstraksi

(a) Perbandingan nilai Ct sampel limbah yang diperkaya dengan SARS-CoV-2 hingga efek matriks yang berbeda; (b) Perbandingan nilai Ct berdasarkan 31 sampel nyata yang tidak diperkaya; (c) Perbandingan nilai Ct sampel yang diperkaya dengan pengenceran gradien dengan PBS; dan (d) Perbandingan nilai Ct sampel yang diperkaya dengan pengenceran gradien dengan limbah.

Kesimpulan

Dalam makalah ini, sebelas metode deteksi coronavirus baru yang berbeda, termasuk prinsip metode yang berbeda, volume limbah yang berbeda, dan metode ekstraksi yang berbeda, dievaluasi menggunakan sampel limbah SARS-CoV-2 yang diperkaya dan sampel limbah nyata yang tidak diperkaya. Secara keseluruhan, metode ultrasentrifugasi volume kecil yang dikombinasikan dengan Viral Kit untuk ekstraksi RNA dengan metode lisat virus memungkinkan deteksi virus SARS-CoV-2 yang cepat dan sensitif dalam air limbah. Hasil penelitian ini memberikan dukungan data dan referensi untuk penerapan metode yang ada atau yang baru dikembangkan untuk deteksi limbah SARS-CoV-2.